生物激光掃描共聚焦顯微鏡在很大程度上依賴于熒光作為成像模式，這主要是由于該技術提供的高度靈敏度以及專門針對化學固定以及活細胞和組織中的結構成分和動態過程的能力。許多熒光探針圍繞合成芳香有機化學物質構建，旨在與生物大分子（例如蛋白質或核酸）結合或定位在特定結構區域內，例如細胞骨架、線粒體、高爾基體、內質網和核。其他探針用于監測動態過程和局部環境變量，包括無機金屬離子的濃度、pH、活性氧和膜電位。熒光染料還可用于監測細胞完整性（活細胞與死細胞和凋亡）、內吞作用、胞吐作用、膜流動性、蛋白質運輸、信號轉導和酶活性。此外，熒光探針已廣泛應用于分子遺傳學領域的遺傳作圖和染色體分析。

合成熒光探針的歷史可以追溯到一個多世紀以來的 1800 年代后期，當時開發了許多現代組織學的基石染料。其中包括副玫瑰苯胺、甲基紫、孔雀綠、番紅 O、亞甲藍和許多偶氮（氮）染料，例如俾斯麥棕。盡管這些染料顏色很深，并且能夠吸收選定的可見光波段，但大多數只是微弱的熒光，對幾十年后開發的熒光顯微鏡沒有用處。然而，在此期間合成的幾種基于呫噸和吖啶雜環系統的合成染料類被證明具有高熒光性，為現代合成熒光探針的發展奠定了基礎。

熒光染料在 20 世紀初被引入熒光顯微鏡，作為細菌、原生動物和錐蟲的重要染色劑，但直到 1920 年代熒光顯微鏡首次用于研究固定組織和活細胞中的染料結合時才得到廣泛使用。然而，直到 1940 年代初，Albert Coons 才開發出一種用熒光染料標記抗體的技術，從而催生了免疫熒光領域。在過去的 60 年中，免疫學和分子生物學的進步已經產生了廣泛的二抗，并為針對大分子復合物中特定區域的熒光探針的分子設計提供了見解。

熒光探針技術和細胞生物學因從水母中發現綠色熒光蛋白 ( GFP ) 和突變光譜變體的發展而發生了巨大變化，這為亞細胞蛋白定位、分子間相互作用的非侵入性熒光多色研究打開了大門，使用活細胞培養物進行販運。最近，納米級熒光半導體量子點的發展為共聚焦和寬場熒光顯微鏡的研究提供了新的途徑。盡管過去幾十年在熒光染料合成方面取得了許多進展，但關于開發新熒光染料的分子設計規則的確鑿證據很少，特別是在將吸收光譜與可用的共聚焦激光激發波長匹配方面。因此，已發現在共聚焦顯微鏡中廣泛使用的熒光團數量是已發現的數千個熒光團的有限子集。

轉載于：https://www.olympus-lifescience.com/ja/microscope-resource/primer/techniques/confocal/fluorophoresintro/